La nuova tecnica di microscopia riproduce le cellule vive con una sensibilità 7 volte maggiore

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I ricercatori dell’Università di Tokyo hanno trovato un modo per migliorare la sensibilità dell’imaging in fase quantitativa esistente in modo che tutte le strutture all’interno delle cellule viventi possano essere viste simultaneamente, dalle minuscole particelle alle grandi strutture. Questa rappresentazione artistica della tecnica mostra impulsi di luce scolpita (verde, in alto) che viaggiano attraverso una cella (al centro) ed escono (in basso) dove i cambiamenti nelle onde luminose possono essere analizzati e convertiti in un’immagine più dettagliata. Credit: s-graphics.co.jp, CC BY-NC-ND

Gli esperti in fisica ottica hanno sviluppato un nuovo modo per vedere all’interno delle cellule viventi in modo più dettagliato utilizzando la tecnologia di microscopia esistente e senza la necessità di aggiungere coloranti o coloranti fluorescenti.

Poiché le singole cellule sono quasi traslucide, le fotocamere per microscopi devono rilevare differenze estremamente sottili nella luce che passa attraverso le parti della cellula. Queste differenze sono note come la fase della luce. I sensori di immagine della fotocamera sono limitati dalla quantità di differenza di fase della luce che possono rilevare, denominata gamma dinamica.

“Per vedere maggiori dettagli utilizzando lo stesso sensore di immagine, dobbiamo espandere la gamma dinamica in modo da poter rilevare piccoli cambiamenti di fase della luce”, ha detto il professore associato Takuro Ideguchi dell’Istituto di scienza e tecnologia dei fotoni dell’Università di Tokyo.

Il team di ricerca ha sviluppato una tecnica per prendere due esposizioni per misurare separatamente grandi e piccoli cambiamenti nella fase di luce e poi collegarli senza soluzione di continuità per creare un’immagine finale altamente dettagliata. Hanno chiamato il loro metodo Adaptive Dynamic Range Shift Quantitative Phase Imaging (ADRIFT-QPI) e recentemente hanno pubblicato i loro risultati su Light: Science & Applications.

“Il nostro metodo ADRIFT-QPI non ha bisogno di laser speciali, microscopi o sensori di immagine speciali; possiamo usare cellule vive, non abbiamo bisogno di macchie o fluorescenza e ci sono pochissime possibilità di fototossicità”, ha detto Ideguchi.

La fototossicità si riferisce all’uccisione delle cellule con la luce, che può diventare un problema con alcune altre tecniche di imaging, come l’imaging a fluorescenza.

Immagini di sfere di silice scattate utilizzando la convenzionale fase quantitativa (in alto) e un’immagine più chiara prodotta utilizzando un nuovo metodo di microscopia ADRIFT-QPI (in basso) sviluppato da un gruppo di ricerca presso l’Università di Tokyo. Le foto a sinistra sono immagini della fase ottica e le immagini a destra mostrano il cambiamento di fase ottica dovuto all’assorbimento della luce nel medio infrarosso (molecolare specifico) da parte delle sfere di silice. In questa dimostrazione di prova, i ricercatori hanno calcolato di aver raggiunto una sensibilità circa 7 volte maggiore con ADRIFT-QPI rispetto a quella con QPI convenzionale. Credit: Toda et al., CC-BY 4.0

L’imaging di fase quantitativa invia un impulso di un foglio di luce piatto verso la cellula, quindi misura lo sfasamento delle onde luminose dopo che sono passate attraverso la cellula. L’analisi al computer ricostruisce quindi un’immagine delle principali strutture all’interno della cellula. Ideguchi e i suoi collaboratori hanno già sperimentato altri metodi per migliorare la microscopia di fase quantitativa.

L’imaging in fase quantitativa è un potente strumento per esaminare le singole cellule perché consente ai ricercatori di effettuare misurazioni dettagliate, come il monitoraggio del tasso di crescita di una cellula in base allo spostamento delle onde luminose. Tuttavia, l’aspetto quantitativo della tecnica ha una bassa sensibilità a causa della bassa capacità di saturazione del sensore di immagine, quindi il tracciamento di particelle di dimensioni nanometriche all’interno e intorno alle cellule non è possibile con un approccio convenzionale.

Il nuovo metodo ADRIFT-QPI ha superato la limitazione della gamma dinamica dell’imaging in fase quantitativa. Durante ADRIFT-QPI, la fotocamera esegue due esposizioni e produce un’immagine finale che ha una sensibilità sette volte maggiore rispetto alle tradizionali immagini di microscopia di fase quantitativa.

La prima esposizione viene prodotta con l’imaging di fase quantitativa convenzionale: un foglio di luce piatto viene pulsato verso il campione e gli sfasamenti della luce vengono misurati dopo che è passata attraverso il campione. Un programma di analisi dell’immagine del computer sviluppa un’immagine del campione in base alla prima esposizione, quindi disegna rapidamente un fronte d’onda scolpito di luce che rispecchia l’immagine del campione. Un componente separato chiamato dispositivo di modellazione del fronte d’onda genera quindi questa “scultura di luce” con una luce di maggiore intensità per un’illuminazione più forte e la spinge verso il campione per una seconda esposizione.

Se la prima esposizione produceva un’immagine che fosse una rappresentazione perfetta del campione, le onde luminose della seconda esposizione scolpite su misura entrerebbero nel campione in diverse fasi, passerebbero attraverso il campione, quindi emergerebbero come un foglio di luce piatto, provocando il fotocamera per vedere nient’altro che un’immagine scura.

“Questa è la cosa interessante: cancelliamo in qualche modo l’immagine del campione. Non vogliamo vedere quasi nulla. Cancelliamo le grandi strutture in modo da poter vedere quelle più piccole in grande dettaglio”, ha spiegato Ideguchi.

Un’immagine standard (in alto) acquisita utilizzando l’imaging in fase quantitativa convenzionale e un’immagine più chiara (in basso) prodotta utilizzando un nuovo metodo di microscopia ADRIFT-QPI sviluppato da un gruppo di ricerca presso l’Università di Tokyo. Le foto a sinistra sono immagini della fase ottica e le immagini a destra mostrano il cambiamento di fase ottica dovuto all’assorbimento della luce nel medio infrarosso (molecolare specifico) principalmente da parte delle proteine. La freccia blu punta verso il bordo del nucleo, la freccia bianca punta verso i nucleoli (una sottostruttura all’interno del nucleo) e le frecce verdi punta verso altre grandi particelle. Credit: Toda et al., CC-BY 4.0

In realtà, la prima esposizione è imperfetta, quindi le onde luminose scolpite emergono con sottili deviazioni di fase.

La seconda esposizione rivela minuscole differenze di fase della luce che sono state “sbiadite” da differenze maggiori nella prima esposizione. Questa piccola differenza di fase della luce rimanente può essere misurata con una maggiore sensibilità grazie alla maggiore illuminazione utilizzata nella seconda esposizione.

Un’ulteriore analisi al computer ricostruisce un’immagine finale del campione con una gamma dinamica espansa dai due risultati di misurazione. Nelle dimostrazioni proof-of-concept, i ricercatori stimano che ADRIFT-QPI produca immagini con una sensibilità sette volte maggiore rispetto all’imaging in fase quantitativa convenzionale.

Ideguchi afferma che il vero vantaggio di ADRIFT-QPI è la sua capacità di vedere minuscole particelle nel contesto dell’intera cellula vivente senza bisogno di etichette o macchie.

“Ad esempio, potrebbero essere rilevati piccoli segnali da particelle su nanoscala come virus o particelle che si muovono all’interno e all’esterno di una cellula, il che consente l’osservazione simultanea del loro comportamento e dello stato della cellula”, ha detto Ideguchi.

Articolo tradotto da: https://phys.org/

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